Biología celular y Biotecnología

Nucleación del huso mitótico y su coordinación con el ciclo celular

Dr Victor Álvarez Tallada
Investigador/a Asociado/a a Dr Juan Jiménez Martínez

Resumen
Cinco publicaciones relevantes
Miembros del laboratorio y colaboradores

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Resumen

En el Lab 126 estamos trabajando en dos líneas centrales de investigación:

1.- Activación y regulación de las etapas iniciales del ensamblaje de microtúbulos interfásicos y mitóticos.

 
Numerosas funciones biológicas en interfase y la segregación equitativa de la información genética entre las dos células hijas generadas por mitosis, o entre los cuatro gametos que se generan por meiosis, dependen dramáticamente de la función de los haces de microtúbulos. En interfase, los microtúbulos tienen funciones morfológicas y de transporte entre otras. En mitosis y meiosis atrapan físicamente las masas cromosómicas y las separan hacia polos opuestos de la célula. Los microtúbulos se polimerizan desde unos complejos proteicos denominados MTOCS (del inglés MicroTubule Organising Centers) en interfase y Centrosomas en mitosis y meiosis. La nucleación efectiva se produce desde el subcomplejo ɣ -Tubulin (ɣ -TuSC), muy fielmente conservado evolutivamente en eucariotas, desde levaduras hasta humanos. Sin embargo, gran parte de los mecanismos moleculares por los que el ɣ -TuSC activa o desactiva la nucleación de microtúbulos y cómo este proceso se coordina con el ciclo celular o responde a situaciones que alteran la fisiología normal de la célula, todavía no están bien caracterizados. Sin embargo, está muy bien documentado que mutaciones en muchos de estos genes que alteran la función del huso conducen a separaciones aberrantes del material genético (aneuploidías) que son la causa molecular de varios tipos de tumores. Por eso, en nuestro laboratorio usamos la levadura de fisión S. pombe como sistema modelo para investigar las señales moleculares que activan y modulan la intensidad de la nucleación de microtúbulos. Este organismo, ampliamente usado en investigación, es un sistema extremadamente versátil experimentalmente. Nos permite combinar poderosas técnicas de Genética, Biología Celular y Molecular, Microscopía confocal de alta velocidad en células vivas, Bioquímica y análisis “ómicos” de vanguardia; para investigar los mecanismos moleculares que gobiernan la función de nucleación de microtúbulos y caracterizar la acción de nuevos elementos implicados en su regulación.
En nuestro grupo disponemos de mutantes como el de la imagen 1 en los que sólo se activa uno de los centrosomas (arriba ejemplo de una célula silvestre, abajo una mutante); o el de la imagen 2 en los que la profase, que normalmente tarda 2 minutos, se prolonga hasta 40 minutos sin activación de los centros nucleadores. Estos y otros mutantes que manejamos en nuestro laboratorio son excelentes fondos genéticos para preguntar qué factores son necesarios para activar la síntesis de microtúbulos.


 

 
Imagen 2


2.- Relación funcional entre factores de procesamiento del RNA para el mantenimiento de la estabilidad genómica.

La correcta duplicación y segregación de los cromosomas resulta esencial para la viabilidad de cualquier célula eucariota. La acumulación de mutaciones y reordenaciones o el reparto asimétrico del material genético durante el proceso mitótico desembocan en defectos celulares conocidos genéricamente como inestabilidad genómica. Esta es una característica común en el proceso de envejecimiento, en diversas enfermedades congénitas y especialmente en diferentes tipos de cáncer. Las reordenaciones cromosómicas y la herencia asimétrica en el número de cromosomas (aneuploidías) afecta a su vez a las anomalías de divisiones posteriores, siendo responsables de la heterogeneidad celular dentro del propio tumor. Esta heterogeneidad genómica intra-tumoral, es la que determina aspectos tan importantes en la evolución del proceso oncogénico como el desarrollo de metástasis y la resistencia a la terapia. En nuestro laboratorio hemos identificado una nueva mutación condicional responsable de un fenotipo extremo de inestabilidad genómica (imagen 3).



Dicha mutación reside en un gen esencial (su deleción completa es letal) y universalmente conservado en eucariotas. El gen afectado (Cwf15/CWC15/HSPC148) está curiosamente anotado como un factor de splicing, implicado en el procesamiento de RNA. Aunque no se conoce nada de su función molecular, esta proteína ha sido identificada como un antígeno tumoral en la línea celular BLZ211 de cáncer de vejiga. En nuestra experimentación descubrimos que dicha mutación en el gen cwf15 (cwf15-d53) genera dos fenotipos deletéreos muy acusados: En primer lugar, a nivel molecular se observa un aumento muy significativo de la transcripción de regiones intergénicas y antisentido ausentes en la cepa silvestre. Este fenotipo (conocido en inglés como readthrough) viene normalmente provocado por la desregulación de la RNA polimerasa II en el final de la transcripción. Coherentemente, la mutación cwf15-d53 provoca letalidad sintética cuando se suma a la falta de un factor de terminación de la transcripción (Rhn1), que por sí sola es viable. Además, la deleción del factor rhn1 en las mismas condiciones restrictivas para la mutación cwf15-d53 mimetiza el fenotipo de falta de función de cwf15. Por otro lado, sorprendentemente una mutación dominante en otro factor esencial de terminación (Yth1) hace totalmente prescindible la función de cwf15. Por tanto, además de la función asociada al splicing (escisión de secuencias intrónicas no codificantes de los RNA mensajeros), nuestros datos sugieren que este gen posee una función importante y novedosa en la regulación del final de la transcripción. En segundo lugar, a nivel celular observamos una distribución aberrante de la cohesina cargada en los cromosomas, tanto cuantitativa como cualitativamente. Aunque existen indicios de que estos dos fenotipos podrían estar relacionados, no se conoce en detalle el mecanismo molecular que los puede conectar.

Los objetivos de este proyecto de investigación consisten por tanto en determinar la función de esta proteína en la regulación del final de la transcripción; así como el mecanismo molecular que puede conectar esta novedosa función con la dinámica de la cohesina, cuya alteración parece ser la causante de la inestabilidad genómica observada. Los resultados pueden arrojar luz sobre nuevas funciones esenciales en el mantenimiento de la estabilidad genómica e identificar dianas moleculares aún desconocidas para el desarrollo de nuevos tratamientos en enfermedades con esta base genética. En la actualidad estamos tratando también de demostrar la función de este gen en el desarrollo y la conservación evolutiva de los procesos que estudiamos entre S. pombe y D. melanogaster en colaboración con el grupo del Dr. James Castelli.

¿Porqué la levadura de fisión cómo modelo?

Nuestro modelo biológico, Schizosaccharomyces pombe es un hongo ascomiceto unicelular con forma cilíndrica. Se conoce habitualmente como levadura de fisión porque crece en interfase por las puntas de la célula y en mitosis se divide por fisión en la parte central, generando dos células hijas de igual tamaño. Esta levadura se usa como modelo de numerosos procesos biológicos desde 1950 por la posibilidad que ofrece, en comparación con otros modelos, de simplificar el estudio procesos muy complejos. Uno de los numerosos ejemplos se ilustra en el descubrimiento por vez primera de los factores principales que regulan el progreso, las transiciones y los puntos de control (checkpoints) del ciclo celular; procesos comunes a todas las células eucariotas, desde levadura a humano. De hecho, debido al interés que suscita esta levadura, el genoma de S. pombe fue el sexto genoma eucariota en ser secuenciado completamente.
La potencia experimental de esta levadura radica en aspectos que en su conjunto resultan diferenciales con otros modelos. Tiene un tiempo de generación entre 2,5 y 4 horas (en una noche podemos tener tataranietas); su cultivo es muy sencillo y poco costoso; se transforma muy fácilmente con DNA exógeno y sus sistemas de recombinación homóloga permiten integraciones dirigidas en el genoma que habilitan una edición génica de gran potencia; existen multitud de plásmidos, promotores constitutivos y regulables y marcadores de selección; en la comunidad disponemos de decenas de miles de mutantes constitutivos y condicionales, así como marcajes con proteínas fluorescentes para microscopía en células vivas que permiten elaborados estudios dinámicos. Pero sin duda la versatilidad genética es la característica más diferencial. Podemos propagarla en ciclo haploide o diploide, lo que nos permite el estudio directo de mutaciones recesivas o mantener mutaciones deletéreas en heterocigosis. Podemos cruzar dos estirpes haploides de distinto sexo para separar y analizar individualmente los 4 gametos (esporas) provenientes de meiosis individuales. Esto nos permite la obtención de combinatorias de mutantes múltiples de forma muy rápida y eficaz. De hecho, la automatización de todos estos procesos ha generado estudios masivos de sensibilidad a drogas o interacciones genéticas entre mutantes (conocidos como High Throughput Screens o HTS) que siguen aportando información tremendamente valiosa sobre el funcionamiento de una célula viva.